Стр. 9 из 24

Pу

сский

Leica Biosystems  Leica HER2 FISH System - 30 Test Инструкции по использованию TA9217 RU-CE-Rev_D 11/11/2013

Pу

сский

Оценка и подсчет количества сигналов

Для оценки качества сигналов и подсчет количества сигналов HER2 и CEP17 проделайте 

следующее:

1. Оценка качества предметных стекол

Оцените качество предметных стекол по следующим критериям:

•

  Интенсивность  сигнала  зонда:

  Сигналы  должны  быть 

отчетливыми  и  легко  оцениваемыми.  Сигналы  должны  иметь  либо 
отчетливую, компактную овальную, либо растянутую, расплывчатую 
овальную форму.

• 

Фон:

Фон  должен  содержать  относительно  мало  флуоресцентных 

частиц и выглядеть темным или черным.

См.  Руководство  по  устранению  неисправностей  (Taблица  6),  если 
какая-либо из указанных функций работает неудовлетворительно и при 
необходимости повторите анализ.

2. Распознавание заданных сигналов

Убедитесь, что для анализа используются нужные фильтры:

•

  Обзор  ткань:

  Подсчитывать  количество  сигналов  гибридизации 

следует  только  у  клеток  инвазивных  опухолей.  Клетки  опухоли 
можно отличить от нормальных клеток по размеру: как правило они 
крупнее обычных клеток, лимфоцитов и клеток эпителия. Определите 
и  выберите  целевые  зоны  пятном  H&E  и  пометьте  эти  зоны  на 
покровном стекле после выполнения FISH-анализа.

•

  Глубина фокуса:

Отрегулируйте глубину резкости, чтобы определить 

глубину  фокальной  плоскости  и  узнать  форму  и  размер  целевых 
сигналов и шума (мусор).

1. Оценка 
качества 
предметных 
стекол

-  

Интенсивность 
сигнала зонда

- Фон

2. Распознава-
ние заданных 
сигналов

- 

Обзор ткань

- Глубина фокуса

3. Пригодность 
ядер

- 

Выбор ядер

3. Пригодность ядер

Обзор гибридизированной области с помощью объектива 20X: 

•

  Выбор  ядер:

  Определите  интересующую  зону  (клетки  опухоли, 

идентифицированные пятном H&E). Избегайте областей с нечеткими 
границами ядер и омертвевшими клетками.

•

Кроме  того,  следует  игнорировать  сигналы  слабой  интенсивности  и 
неопределенный,  шумный  фон  или  недостаточное  контрпятно  для 
определения  границы  ядра.  Следует  подсчитывать  лишь  ядра  с 
дискретными сигналами.

4. Подсчет сигналов

• 

Обзор опухолей:

 Просканируйте несколько областей клеток опухоли, 

чтобы учесть возможную гетерогенность, с помощью объектива 40X. 
Избегайте  областей  со  слабыми  сигналами  и  выберите  область  с 
хорошим распределением ядер.

• 

Подсчет:

Начните  анализ  в  верхнем  левом  квадранте  выбранной 

области  и,  сканируя  слева  направо,  подсчитайте  количество 
сигналов в рамках границ ядра с помощью объектива 100X согласно 
инструкциям, приведенным ниже и на рис. 1.

•  Найдите  все  присутствующие  в  ядре  сигналы,  фокусируясь  вверх  и 

вниз (по оси Z).

•  Два сигнала одного размера, находящиеся на расстоянии друг от друга 

меньшем либо равном диаметру сигнала, считайте как один сигнал.

•  Ядра без сигналов или с сигналами только одного цвета не следует 

засчитывать.  Засчитывайте  только  ядра  с  одним  или  более  FISH-
сигналами каждого цвета.

•  Подсчитайте  количество  сигналов  HER2  и  сигналов  CEP17  для 

каждого ядра. При необходимости чередуйте разные наборы фильтров 
– оранжевый (HER2), зеленый (CEP17), зеленый / оранжевый и DAPI/
зеленый / оранжевый, чтобы увидеть оба цвета.

4. Подсчет 
сигналов

- 

Обзор опухолей

- Подсчет